Trong kỷ nguyên hiện đại, những bước nhảy vọt lớn trong lĩnh vực khoa học tổng hợp peptide đã cho phép sản xuất các peptide tùy chỉnh trên quy mô lớn. Với sự gia tăng sản xuất peptide tổng hợp cho nghiên cứu, việc thực hiện các phương pháp tinh chế peptide hiệu quả chỉ trở nên quan trọng hơn. 

Peptide là các phân tử phức tạp, và sự phức tạp này có thể làm cho các phương pháp tinh chế khác có hiệu quả trên các hợp chất hữu cơ khác không hiệu quả. Trong quá trình tổng hợp, phải đặc biệt chú ý đến việc tối đa hóa cả hiệu quả và năng suất để cung cấp cho khách hàng peptide tinh khiết nhất có thể ở mức giá thấp nhất có thể. Trong khi các quá trình tinh chế dựa trên kết tinh thường có hiệu quả với các hợp chất khác, nhiều quá trình tinh chế peptide sử dụng các nguyên tắc sắc ký, chẳng hạn như sắc ký pha đảo ngược áp suất cao.

LOẠI BỎ CÁC TẠP CHẤT CỤ THỂ TỪ PEPTIDES

1-Loại bỏ các tạp chất cụ thể từ peptide

Như đã đề cập trước đây, điều quan trọng là peptide tổng hợp cuối cùng càng tinh khiết càng tốt để sử dụng nghiên cứu. Mức độ tinh khiết tối thiểu chấp nhận được có thể khác nhau giữa các mục đích nghiên cứu khác nhau; ví dụ, các nghiên cứu in vitro thường yêu cầu tiêu chuẩn độ tinh khiết cao hơn nhiều (lớn hơn 95%) so với thực hiện tiêu chuẩn ELISA để đo hiệu giá kháng thể (độ tinh khiết tối thiểu chấp nhận được lớn hơn 70%). Tuy nhiên, mức độ tinh khiết tối thiểu phải đạt được. Để đảm bảo rằng các tiêu chuẩn độ tinh khiết được đáp ứng, điều quan trọng là phải nhận ra các loại tạp chất có thể phát sinh cũng như bản chất của chúng. Sau đó, phương pháp thanh lọc thích hợp (hoặc phương pháp) có thể được thực hiện.

Trong quá trình tổng hợp peptide, các tạp chất cụ thể có thể xảy ra bao gồm các sản phẩm thủy phân của liên kết amide không bền, trình tự xóa được tạo ra chủ yếu trong tổng hợp peptide pha rắn (SPPS), diastereome và peptide chèn và các sản phẩm phụ được hình thành trong quá trình loại bỏ các nhóm bảo vệ. Tạp chất thứ hai này có thể xảy ra trong bước cuối cùng của quá trình tổng hợp peptide. Ngoài ra, các dạng polyme của peptide dự định được tổng hợp cũng có thể xảy ra, thường phát sinh như một sản phẩm phụ do sự hình thành các peptide tuần hoàn có liên kết disulpide.

2-Chiến lược tinh chế Peptide

Lý tưởng nhất, phương pháp thanh lọc nên càng đơn giản càng tốt, đạt được độ tinh khiết được nhắm mục tiêu trong càng ít bước càng tốt. Thông thường, hai hoặc nhiều quá trình thanh lọc được tiến hành tuần tự có thể cho kết quả tuyệt vời, đặc biệt khi mỗi quá trình hoạt động thông qua các nguyên tắc sắc ký khác nhau. Ví dụ, sắc ký trao đổi ion được sử dụng kết hợp với sắc ký pha đảo ngược có thể dẫn đến một sản phẩm cuối cùng rất tinh khiết.

Nói chung, bước đầu tiên trong quá trình tinh chế peptide là một bước thu giữ loại bỏ phần lớn các tạp chất khỏi hỗn hợp peptide tổng hợp. Nhiều tạp chất được loại bỏ trong giai đoạn này được tạo ra trong bước khử bảo vệ cuối cùng của quá trình tổng hợp peptide và hầu hết không tích điện và có trọng lượng phân tử nhỏ. Mặc dù một lượng tạp chất đáng kể có thể được loại bỏ trong bước ban đầu này, bước tinh chế thứ hai có thể được thêm vào nếu yêu cầu mức độ tinh khiết cao hơn. Bước thứ hai này có thể được gọi là bước đánh bóng và có hiệu quả cao, đặc biệt là khi hoạt động theo nguyên tắc sắc ký bổ sung như đã đề cập trước đây.

QUY TRÌNH TINH CHẾ PEPTIDES

molecule or atom, Abstract atom or molecule structure for Science or medical background, 3d illustration.

3-Quy trình tinh chế Peptide

Hệ thống tinh chế peptide có thể bao gồm hệ thống chuẩn bị đệm, hệ thống phân phối dung môi, hệ thống phân đoạn và hệ thống thu thập dữ liệu, cùng với các cột và máy dò quan trọng. Thật vậy, cột là trái tim của hệ thống thanh lọc và các tính năng được lựa chọn của nó có thể rất quan trọng đối với hiệu quả của quy trình. Một cột có thể có các tính năng được xây dựng bằng thủy tinh hoặc thép cùng với các chế độ nén tĩnh hoặc động, bất kỳ chế độ nào trong số đó có thể ảnh hưởng đến kết quả thanh lọc cuối cùng.

Ngoài ra, điều quan trọng là tất cả các phương pháp thanh lọc được thực hiện theo Thực hành sản xuất tốt (cGMP) hiện tại và vệ sinh được ưu tiên cao nhất.

3.1.Sắc ký ái lực (AC)

sắc kí ái lực AC

Quá trình này cô lập các peptide bằng cách tận dụng sự tương tác giữa một peptide và một phối tử cụ thể gắn liền với ma trận sắc ký. Peptide mong muốn liên kết với phối tử và vật liệu không liên kết bị cuốn trôi. Điều quan trọng, ràng buộc này có thể đảo ngược. Các điều kiện được thay đổi để trở nên thuận lợi cho việc giải hấp, có thể được thực hiện cụ thể hoặc không cụ thể. Giải hấp cụ thể được thực hiện bằng cách sử dụng phối tử cạnh tranh và quá trình giải hấp không đặc hiệu được thực hiện bằng cách thay đổi pH, cực tính hoặc cường độ ion. Peptide được nhắm mục tiêu sau đó được thu thập ở dạng tinh khiết. AC cung cấp cả độ phân giải cao và dung lượng mẫu.

3.2.Sắc ký trao đổi ion (IEX)

Quá trình tinh chế này tận dụng sự khác biệt về điện tích giữa các peptide trong hỗn hợp. Các peptide của một điện tích được phân lập khi đối mặt với môi trường sắc ký có điện tích ngược lại. Peptide được nạp vào một cột và liên kết; Các điều kiện sau đó được thay đổi để các chất liên kết được pha loãng khác nhau. Các điều kiện được thao tác là mức độ nồng độ muối hoặc thay đổi mức độ pH. Thông thường, muối (NaCl) được sử dụng để pha loãng hỗn hợp. Peptide mong muốn được tập trung trong quá trình liên kết và sau đó được thu thập ở dạng tinh khiết. IEX là một quy trình có độ phân giải cao và dung lượng cao.

sắc kí trao đổi ion IEX

3.3.Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC)

Quá trình này hoạt động theo nguyên tắc kỵ nước. Các peptide được nhắm mục tiêu có thể được phân lập do sự tương tác giữa peptide và bề mặt kỵ nước của môi trường màu. Sự tương tác này có thể đảo ngược, cho phép peptide được cô đặc và tinh chế. Bộ đệm cường độ ion cao giúp tăng cường quy trình, làm cho HIC trở thành một phương pháp tinh chế hiệu quả cao để thực hiện sau phương pháp tinh chế ban đầu sử dụng muối trong quá trình pha loãng (như kỹ thuật IEX).

Trong HIC, các mẫu trong dung dịch cường độ ion cao liên kết với nhau khi chúng được nạp lên một cột. Tiếp theo, pha loãng được thực hiện thông qua việc giảm nồng độ muối dẫn đến các chất liên kết được pha loãng khác nhau. Một phương pháp thực hiện điển hình liên quan đến việc sử dụng ammonium sulfate để pha loãng mẫu trên độ dốc giảm. Peptide mong muốn sau đó được thu thập ở dạng cô đặc và tinh khiết. HIC cung cấp mức độ phân giải và dung lượng mẫu tốt.

sắc ký tương tác kỵ nước HIC

3.4.Lọc gel (GF)

Lọc gel cô lập peptide bằng cách tận dụng sự khác biệt về kích thước phân tử giữa các peptide được nhắm mục tiêu và tạp chất. GF chỉ được sử dụng trên các mẫu thể tích nhỏ. Tuy nhiên, quá trình này cung cấp độ phân giải rất tốt.

lọc gel GF

3.5.Sắc ký pha đảo ngược (RPC)

Quá trình tinh chế này cung cấp độ phân giải rất cao và tách peptide khỏi các chất gây ô nhiễm bằng cách sử dụng sự tương tác thuận nghịch giữa các phân tử đích và bề mặt kỵ nước của môi trường sắc ký. Các mẫu được tải lên một cột và liên kết với nhau. Tiếp theo, các điều kiện được thay đổi để các chất liên kết này được pha loãng khác nhau. Dung môi hữu cơ và các chất phụ gia khác thường được yêu cầu để pha loãng, vì liên kết ban đầu rất mạnh do bản chất của ma trận pha đảo ngược. Nói chung, elution được thực hiện bằng cách tăng nồng độ dung môi hữu cơ, điển hình là acetonitrile. Các phân tử đậm đặc do quá trình liên kết sau đó được thu thập ở dạng tinh khiết. RPC thường được sử dụng như một bước đánh bóng với các mẫu peptide và oligonucleotide. Nó rất hiệu quả để phân tách phân tích như ánh xạ peptide. Tuy nhiên, vì dung môi hữu cơ có thể làm biến tính nhiều peptide, RPC không phải là một quá trình tinh chế lý tưởng nếu các yêu cầu yêu cầu phục hồi hoạt động và quay trở lại cấu trúc bậc ba chính xác.

sắc ký pha đảo ngược RPC

4.Tuân thủ GMP

Trong suốt quá trình tổng hợp và tinh chế peptide, phải đặc biệt chú ý đến việc tuân theo GMP. Điều này là để đảm bảo rằng peptide cuối cùng là tinh khiết và chất lượng cao. GMP yêu cầu các quy trình hóa học và phân tích được thực hiện phải được ghi chép đầy đủ. Các phương pháp thử nghiệm và thông số kỹ thuật được yêu cầu phải được thiết lập trước, đảm bảo rằng quá trình sản xuất được kiểm soát và tái sản xuất.

tuân thủ gmp

Yêu cầu GMP cho giai đoạn tinh chế tổng hợp peptide đặc biệt nghiêm ngặt. Điều này là do quá trình này là một bước muộn trong quá trình tổng hợp tổng thể và có tác động lớn đến chất lượng của peptide cuối cùng. Các bước và tham số quan trọng phải được xác định, cùng với các giới hạn cho các tham số đó, để quá trình có thể tái tạo trong các giới hạn được xác định trước đó. Các thông số quan trọng của quá trình tinh chế peptide có thể bao gồm tải cột, tốc độ dòng chảy, hiệu suất cột, quy trình làm sạch cột, thành phần của bộ đệm pha loãng, thời gian lưu trữ trong quá trình và gộp các phân số.